外泌体：从纯化、质控到检验
一、什么是外泌体
外泌体（Exosome）属于细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EV）的一种亚型，是一类由脂质双分子层包裹形成的微小囊泡，直径通常为 30-150 nm。其膜结构主要由脂质和蛋白质构成，而内容物除蛋白质外，还包含 DNA、mRNA、microRNA 及 ncRNA 等多种核酸分子。其核心功能包括：免疫调节、组织修复。在生命科学研究中，可用于病理机制、肿瘤进展研究、还具有药物递送潜力，因此成为研究热点之一。
二、外泌体的特征
外泌体有自己独特的一些特征，这些特征为外泌体的分离、检测与功能研究提供了分子学基础。
三、外泌体的分离与纯化
常用提取外泌体的方法多种多样，研究者可根据实验条件、实验目的进行选择。根据国际细胞外囊泡学会（ISEV）发布第三版指南常见方法有这么几种：
P：沉淀法
dUC：差速超速离心法
FC：过滤浓缩
DG：密度梯度离心
SEC：尺寸排阻色谱法
AP：亲和沉淀法
AF4：非对称流场流分级
在外泌体分离中，不同方法在回收率(产率)和特异性上存在差异。上图中蓝色虚线箭头提示，通过组合多种方法，可以在保证回收率的同时进一步提升特异性。
需要注意的是：
1、目前市面上不少号称“外泌体纯化”的试剂盒，采用的其实是沉淀法(P),分离得到的往往是包含外泌体在内的多种细胞外颗粒(EPs),并不能保证纯度；
2、亲和沉淀法(AP)在特异性方面优于单纯沉淀，但它识别的是更广泛的细胞外囊泡亚群，并非专一针对外泌体。[1]
四正柏在流式检测产品的基础上，联合合作伙伴HansaBioMed（全球最早且唯一完全聚焦外泌体分离、分析与标准化工具开发的企业）推出多种外泌体分离与纯化工具。
1、PURE-EVs 与 PURE-EV-PLUS：第二代体积排阻色谱柱
新型高效体积排阻色谱（SEC）柱，适用于从生物流体（如血浆、血清、尿液）及细胞培养基中分离高纯度细胞外囊泡（EVs）。是从不同基质中分离和纯化细胞外囊泡（EVs）的最佳方法之一，能快速有效地将 EVs 与循环蛋白分离，并保持囊泡的原始形状和功能。HansaBioMed提供PURE-EVs、miniPURE-EVs 和 maxi-PURE-EVs 等不同尺寸的柱子，可用于从 100 微升至 20 毫升不同基质的液体中纯化 EVs。PURE-EVs PLUS，它与 SEC 柱一起，包括一个专为浓缩稀释液体或稀释的 EV 制剂而设计的 TFF-Easy 浓缩器。对分离出的外泌体进行多种分析（纳米颗粒跟踪分析、酶联免疫吸附测定、荧光激活细胞分选、蛋白质免疫印迹、电子显微镜、质谱、核酸提取等）。
优点：操作简便快捷（周转时间约 15 分钟）。
从少量样品中分离外泌体。
PURE-EVs PLUS 包括专为 EV 浓缩设计的 TFF-Easy 浓缩器。
可重复使用多达 5 次。
易于储存和运输（4°C）。
2、EXO-FILTER：用于细胞外囊泡纯化的离子交换色谱膜
该装置包含一张强正电荷膜，可有效捕获带负电荷的细胞外囊泡（EVs）。若与体积排阻色谱（SEC）或切向流过滤（TFF）联用，此滤膜可成为从血浆、血清等复杂生物流体中纯化细胞外囊泡（EVs）的理想解决方案。
ExoFilter™是一种基于电荷的吸附过滤器，可处理小体积和大体积样本，并用于从复杂生物流体中纯化细胞外囊泡。该过滤器使用强正电荷膜来有效捕获带负电荷的细胞外囊泡（EVs）。
Exo - Filter 与尺寸排阻色谱法（如 PURE - EVs 柱和切向流过滤（TFF））结合使用时，可提高从血浆或血清等复杂生物流体中提取的 EVs 的纯度。
应用：捕获带负电荷的颗粒，包括细胞外囊泡；提高复杂生物流体中 EVs 的纯度。
优点：操作简单快速（周转时间约 10 分钟）；无需收集馏分；可在室温下储存和运输。
3、免疫亲和捕获细胞外囊泡
包含乳胶免疫磁珠或磁性免疫磁珠（EV-IBeads，即细胞外囊泡免疫磁珠），以及酶联免疫吸附测定（ELISA）免疫板（EV-IPlates，即细胞外囊泡免疫板），适用于从人源生物流体或细胞条件培养基中对总细胞外囊泡（EVs）或特定细胞外囊泡（EVs）进行免疫捕获。
4、EXO-Prep（细胞外囊泡提取试剂盒）
一步法提取试剂盒，可从生物流体（如血浆、血清、尿液）及细胞条件培养基中分离总细胞外囊泡（EVs）。
EXO-Prep 是一种从生物流体和细胞培养上清液中分离细胞外囊泡（EVs）的快速便捷方法。其分离原理基于化学沉淀法：将样本与 EXO-Prep 溶液在冰上孵育，随后通过离心使囊泡沉淀。分离得到的 EVs 适用于多种后续分析，例如纳米颗粒追踪分析（NTA）、通过多种技术（蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定、流式细胞术）进行的蛋白分析、核酸提取以及信使核糖核酸（mRNA）或小核糖核酸（small RNA）标志物的分析
应用：从生物流体和细胞上清液中一步分离 EV。分离出的 EV 可用于 NTA 分析、蛋白质分析（蛋白质免疫印迹法、荧光激活细胞分选术、酶联免疫吸附测定法）以及核酸（核糖核酸和脱氧核糖核酸）提取和分析。
优势：操作步骤简单快捷。沉淀易于在磷酸盐缓冲液（PBS）中重悬。EXO-Prep 能够从少量样品（低至 100 微升血浆）中分离外泌体
四、外泌体的分析检测
外泌体的全面表征需结合物理、生化和功能分析方法，同时需要可靠的阳性对照品以保证实验结果的准确性和可重复性。国际细胞外囊泡学会（ISEV）提出的“三重鉴定法”是细胞外囊泡（EVs）研究领域的核心标准，旨在确保分离囊泡的纯度和身份可靠性。该方法从物理、生化和功能三个维度交叉验证，具体内容及技术要点如下：
形态学特征：透射电镜（TEM）观察典型杯状/茶托状双层膜结构，直径集中于50-120 nm（占比＞70%），腔内电子密度均匀。
粒径分布与浓度：纳米颗粒追踪分析（NTA）检测峰值粒径（70-100 nm）、颗粒浓度（Particles/mL）及多分散指数（PDI＜0.3）。
分子标志物组合：需同时检测阳性标志物（跨膜蛋白+胞质蛋白）和阴性标志物（排除非外泌体污染）
HansaBioMed提供不同的Exo-FACS试剂盒用于人体液（血浆、血清、尿液、唾液）以及细胞培养上清中外泌体提取和标志物的检测。
Exo-FACS试剂盒组分：
1. EXO-Prep，用于外泌体分离
2. 冻干外泌体标准品，用作阳性对照
3. 外泌体标志物抗体（CD9 或 CD63）的专利抗体，用作外泌体鉴定和阳性对照
4. Alexa 488标记二抗
5. 样本稀释液，用于抗体孵育
每个试剂盒可进行20个反应。
另外，我们也可以采取流式检测的方法，更快速地检测外泌体。这里我们介绍下基于微球的流式检测外泌体方法。（bead-based flow cytometry for extracellular vesicles, EVs）
基于微球的流式检测是外泌体表型分析的主流方法，其核心是通过微球载体解决外泌体直接检测的信号瓶颈。实际应用中需严格遵循 MISEV2023 的标准化要求，通过正交验证（如结合 NTA 检测颗粒数、WB 验证标志物）和严格对照，确保结果的可靠性。该方法在临床转化（如液体活检）和基础研究中具有不可替代的价值，尤其适用于低丰度 EV 样本的多标志物分析。其核心原理如下：
载体捕获：将外泌体特异性抗体（如 CD63、CD81、CD9 等经典标志物抗体）包被在微米级微球（直径 1-5μm）表面，利用抗原 - 抗体反应捕获样本中的外泌体，使多个外泌体结合到单个微球上。
信号放大：结合外泌体的微球通过荧光标记的检测抗体（识别外泌体表面其他标志物或同一标志物的不同表位）进一步标记，最终通过微球的散射信号（易被流式识别）和荧光信号（反映外泌体标志物表达）实现对 “微球 - 外泌体复合物” 的检测，间接反映外泌体的存在及表型。
四正柏作为流式领域的最早国产抗体样式，已形成完整的外泌体经典标志物抗体系列，研究人员可根据实验平台自由搭配，用于微球流式检测等应用场景：
五、阳性对照品的选择与应用
阳性对照品是外泌体实验质量控制的关键，理想对照品应具备来源明确、组成稳定、高度均一等特性。为此，四正柏联合HansaBioMed推出多种商品化冻干外泌体标准品（来源于健康血浆、尿液或经典细胞系），以及带荧光表的对照品，以方便科研人员在实验中进行可靠的对照验证。
外泌体研究正快速发展，对分离、检测和质量控制提出了更高要求。
四正柏始终专注于流式产品研发，并在此基础上整合合作伙伴的资源，构建了覆盖外泌体分离—检测—质控的完整解决方案。我们希望能与科研人员携手，共同推动外泌体研究的深入发展与临床转化。
欢迎垂询四正柏团队，获取更多技术支持与产品信息！
参考文献
[1]Joshua A. Welsh, Deborah C. I. Goberdhan ect.Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches.Journal of Extracellular VesiclesVolume 13, Issue 2Feb 2024.
苏州四正柏生物科技有限公司拥有晶美生物、北京四正柏生物20多年的技术积累，现已成长为一家集生命科学研究、临床转化应用、流式技术服务、进出口平台四位一体的国家级高新技术企业。公司于2019年和2022年分别完成数千万元天使轮和Pre-A轮融资，拥有国家专利授权30余项，并承担国家科技部、北京市科委、深圳市科委等四项科研基金项目，获得苏州市高新区创业领军人才项目支持。公司已建成满足ISO9001:2015标准要求的全面质量管理体系，以及达到GMP规范要求的IVD生产线。公司已获医疗器械证260余件。四正柏企业愿景是发展成为全球生命科学和临床诊断领域最具竞争力的高新技术企业之一，植根中国，服务中国，面向世界。
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