流式样本处理：肠道组织单细胞悬液制备标准化操作方案
肠道是人体最大的黏膜免疫器官，黏膜固有层、派尔集合淋巴结（PP）、黏膜/黏膜下孤立淋巴滤泡（ILF）共同构成肠道完整免疫微环境，富集树突状细胞、巨噬细胞、T/B 淋巴细胞、固有免疫细胞、上皮细胞等多种功能细胞群。各类免疫细胞协同调控肠道免疫耐受、抗感染应答、炎症性肠病发生发展及肠道肿瘤免疫平衡，不同细胞亚群在小肠、大肠不同组织区域的分布、表面标志物表达与生物学功能存在显著差异。依托多参数流式细胞术对肠道全细胞群进行分群、分型与定量检测，是解析肠道免疫稳态失衡机制、筛选消化道疾病免疫标志物、评估黏膜细胞活化状态的核心技术手段。
但人肠道组织大量分泌黏液、富含致密胶原纤维与完整上皮屏障，各类免疫细胞表面抗原极易被消化体系中的蛋白酶降解，常规组织消化方案普遍存在细胞活率偏低、各类免疫细胞分离得率不足、稀有细胞亚群丢失、表面标志物表达下调等问题，会直接造成流式分群模糊、检测数据失真，严重影响实验结果可信度。本方案为国际标准化人非淋巴组织免疫细胞分离指南[1]，是一套适配临床手术来源人肠道标本的标准化单细胞悬液制备流程，完整覆盖组织分层解剖、脱黏液处理、上皮剥离、分级酶解全流程，制备单细胞悬液可直接用于肠道全细胞群多色流式分型检测。
一、实验前试剂与耗材准备
（一）试剂配制
1. 基础缓冲液
1）冷HBSS缓冲液
配方：10×HBSS 50 mL + 1M Hepes 8 mL + 青霉素/链霉素 5 mL，超纯水定容至500 mL，4℃保存
2）R5 基础培养基
RPMI 1640 475 mL + 灭活 FBS 25 mL + 双抗5 mL，4℃避光保存
3）DTT脱黏液缓冲液
R5基础培养基预热后，每50 mL R5基础培养基添加200 μL 1M DTT，现配现用
4）EDTA上皮解离缓冲液
每50mL HBSS缓冲液中加入0.5 M EDTA 500uL，37℃预热使用
5）组织消化液（LP/ILF/PP 酶解）
基础：预热 R5培养基 10 mL
酶体系二选一：
方案 A：240 μL 2.5 mg/mL Liberase TM + 150 μL 10 mg/mL DNase I
方案 B：200 μL 5 mg/mL 胶原酶D + 150 μL 10 mg/mL DNase I
6）0.1% 亚甲蓝染色液
1.5% 亚甲蓝母液 1 mL + PBS 14 mL
7）亚甲蓝漂洗缓冲液（去除多余染料）
PBS + 5 mM EDTA （每50mLPBS+500 μL 0.5MEDTA）
2. 耗材与设备
解剖显微镜、25 号解剖弯镊、精细解剖剪、22 号手术刀片、活检打孔器、50/15 mL 离心管、六孔板、100 μm 细胞筛、恒温摇床（37℃）、恒温培养箱、移液管、巴氏管、细胞计数仪
(二）样本来源
手术切除人小肠/大肠标本；包含黏膜层、黏膜下层、肌层、派尔集合淋巴结（PP）、黏膜 ILF、黏膜下 ILF。
二、组织解剖分离分步操作
步骤 1 样本初清洗与肌层剥离
1）离体肠道样本立即置于预冷 R5基础培养中漂洗去除粪便、肠内容物；
2）置于无菌培养皿，解剖镜下用弯镊 + 剪刀完整剥离外层肌层，丢弃肌层组织；
3）将剩余肠壁裁剪为5 cm2块，小肠样本额外用手术刀轻柔刮除绒毛表面厚黏液。
步骤 2 DTT 脱黏液处理
4）每块5 cm²肠道组织放50 mL 试管中，加入10 mL DTT 缓冲液；
5）37℃摇床孵育10 min，弃掉缓冲液，更换新的DTT缓冲液，再次孵育10min；
6）取出组织，转移至含冷R5基础培养的培养皿备用;
步骤 3 黏膜与黏膜下层分离（核心关键步骤）
7）解剖镜下，两把弯镊分别夹持黏膜层、黏膜下层，从组织边角缓慢撕脱分离；
8）分离后将黏膜组织、黏膜下层组织分开放置，冰上R5基础培养基中保存；
9）肉眼识别 PP（小肠特征性白色滤泡团块），手术刀切下，活检打孔器分离单个滤泡；
步骤 4 黏膜下层 ILF 染色分离
10）用PBS清洗黏膜肌层/黏膜下层;
11）黏膜下层组织用0.1%亚甲蓝 37℃染色2 min；
12）用温PBS洗涤;
13）用10 mL温MB冲洗缓冲液洗涤三次，每次2–5分钟，直至缓冲液澄清;
14）在冷R5溶液中，使用透射光源的解剖显微镜配合活检打孔器或手术刀，从黏膜下层提取GALT组织。将黏膜下 ILF 置于冰上保存，直至消化步骤;
步骤 5 上皮细胞剥离（获取上皮内淋巴细胞）
15）分离后的黏膜组织裁剪小块，加入 EDTA 缓冲液；
16）37℃孵育 10 min，重复 3–4 次（结肠 3 次，小肠 4 次），直至无漂浮上皮碎片；
17）收集上清可单独留存上皮细胞，剩余黏膜（固有层 LP）留作 DC 解离;
步骤 6 固有层（LP）/ 淋巴滤泡切碎预处理
18）去除上皮后的 LP 组织、PP 滤泡、黏膜 ILF 全部剪为 2–3 mm 细小碎片；
19）分装置50 mL离心管（大块 LP）或1.5 mL微量管（少量 ILF）。
三、酶消化制备单细胞悬液
1.固有层（LP）批量消化（5–7 cm² 组织）
1) 每管加入10 mL 新鲜消化缓冲液；
2) 37℃恒温摇床370 rpm孵育45 min；
3) 消化结束后巴氏管反复吹打 50 次破碎组织团块；
4) 混合液过100 μm细胞筛，冷R5基础培养基补足至30 mL；
5) 400xg 7 min离心，弃上清，R5基础培养和重悬沉淀，计数备用。
2. 单个ILF 小体积消化
6) 1.5 mL 微量管中每批ILF 加入700 μL消化缓冲液；
7) 37℃热振荡摇床800 rpm，45 min；
8) 用注射器柱塞研磨组织，过100 μm筛过滤；
9) 离心收集细胞，R5基础培养基重悬。
四、后续下游应用
消化所得单细胞悬液可直接：
1) 流式细胞术检测；
2）原代细胞体外功能培养；
3）单细胞 RNA 测序；
五、实验关键注意要点
1．黏膜撕脱技巧：从组织边角起撕，连续缓慢剥离，出现断裂退回边角重新操作；选用尖端锋利弯镊；可剪1 cm 窄条方便抓取。
2．DNase灵活取舍：若后续做单细胞测序且多轮洗涤，可省略消化液 DNase，降低酶对转录本损伤。
3．样本时效性：手术离体肠道尽快处理，放置超过2 h会大幅降低活细胞数量。
4．离心参数：所有细胞收集统一 400xg 7 min，低速减少脆弱细胞破碎。
5．过滤：全程100 μm滤网去除组织团块，避免流式上机堵管。
6．冷冻限制：该方案优先新鲜样本。
另，小编查询了相关文献，整理了一些肠道组织的解离方案，以供参考：
温馨提示：
1.胶原酶是混合酶，批次活性波动大，每次新酶需做消化梯度预实验；
2.肠道炎症会改变组织致密程度，消化条件必须灵活调整；
3.组织剪碎程度、消化时长联动影响最终细胞得率与抗原表达，二者需同步优化；
4.过度消化不可逆破坏表面标志物，会直接导致流式分群失效，不可盲目延长消化时间。
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文献：
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