流式样本处理--肺组织处理
肺组织内包含肺泡上皮、血管内皮、间质成纤维、巨噬、树突状、淋巴细胞等多种异质性细胞亚群，细胞类型繁杂且相互嵌合于致密肺泡间质、气道与微血管结构中，直接固定切片仅能完成组织原位形态观察，无法精准定量各免疫与实质细胞亚群的比例、活化表型、表面标志物表达水平。流式细胞术凭借多荧光标记、高通量单细胞定量的优势，成为解析肺部稳态、损伤、纤维化、感染等病理状态下细胞亚群动态变化的核心技术；而获得高活率、无细胞团聚、完整保留表面抗原的单细胞悬液，是肺组织流式检测成败的决定性前提，不同研究靶细胞（肺泡Ⅱ型上皮、肺微血管内皮、肺泡巨噬、树突状细胞）需匹配专属组织解离体系，标准化操作流程可最大程度减少细胞丢失、抗原降解与实验偏差。
本文整理的操作规范源自权威文献《Guidelines for preparation and flow cytometry analysis of human nonlymphoid tissue DC》[1]，由一线实验从业者撰写、行业同行专家评审，且经全体作者共同核验确认，是适用于基础免疫、临床肿瘤免疫研究的通用标准化操作指南，特此分享供各位科研人员参考借鉴。
一、实验材料与储备液配制
1.所需试剂
2. 所需设备
超净工作台、37℃5% CO?培养箱、离心机、细胞计数仪、无菌精细剪刀、2mL微量离心管、6孔细胞培养板、50mL锥形离心管、10mL无菌移液管、70μm细胞筛、细胞计数板
3. 储备液标准配制（无菌操作，分装冻存避免反复冻融）
（1）DNase I 10 mg/mL母液
无菌双蒸水溶解冻干DNase I，终浓度10mg/mL；单组分分装，-20℃避光保存，一次性使用，禁止冻融循环。
（2）IV型胶原酶10 mg/mL母液
无菌双蒸水溶解胶原酶IV，终浓度10mg/mL；单组分分装，-20℃避光保存，一次性使用。
（3）灭活FBS
1）37℃水浴完全融化FBS；
2）56℃水浴孵育30min灭活补体；
3）超净台内0.22μm滤膜过滤除菌；
4）50mL管分装，-20℃保存。
（4）肺组织专用消化缓冲液（现配现用，20mL 体系）
基础液：RPMI1640 + 10%灭活FBS添加酶终浓度：0.2 mg/mL胶原酶IV + 0.05 mg/mL DNase I，配好后室温短期放置待用，长期放置需冰浴。
二、肺组织单细胞悬液分步操作流程
步骤 1 实验前试剂预平衡
(1) 提前配制20mL肺消化缓冲液；
(2) Ficoll-Paque、1×红细胞裂解液取出，室温平衡备用；
(3) 肺活检样本（1–2cm 组织块）置于2mL含 0.5mL消化缓冲液的微量离心管中暂存。
步骤 2 组织剪碎预处理
(4)无菌精细剪刀将管内肺组织剪为1–2mm微小碎块，保证酶充分浸润组织。
步骤 3 37℃酶消化解离
(5)将全部组织碎块 + 管内消化液转移至 6 孔板单孔，额外补加4mL新鲜消化缓冲液（单孔总消化液约 4.5mL）；
(6)6孔板置于37℃培养箱，恒温孵育1h。
步骤 4 机械吹打释放单细胞
(7)孵育结束后，使用10mL 无菌移液管轻柔上下吹打组织混合液6–8次，打散未完全解离的组织团块。
步骤 5 过滤去除组织残渣
(8)70μm细胞筛架在50mL锥形管上方，将消化全部悬液过筛；
(9)原6孔板用1mL PBS润洗，润洗液同样过筛并入同一50mL 管，减少细胞丢失。
步骤 6 初次离心收集细胞
(10)PBS补足50mL总体积，365×g、25℃离心5min；离心后小心弃上清，细胞沉淀用40mLPBS充分重悬稀释。
步骤 7 Ficoll 密度梯度离心富集单个核细胞（DC 富集核心步骤）
(11)新50mL管底部先铺10mL室温Ficoll-Paque；
(12)缓慢沿管壁将40mL稀释细胞悬液平铺于Ficoll上层，严禁两层液体混合；
(13)离心机参数：1800 × g，室温，25min；加速档 0–1、刹车档 0–1（无减速，避免分层破坏）；
(14)离心分层：上层PBS层、中间白膜层（单个核细胞）、下层Ficoll、红细胞沉淀。
步骤 8 收集单个核细胞层
(15)无菌移液小心吸取中间白膜细胞层，转移至全新50mL离心管，PBS加满至50mL。
步骤 9 洗涤去除 Ficoll 杂质
(16)365×g、4℃离心5min，离心机最大加速+最大刹车，弃全部上清。
步骤 10 红细胞裂解
(17)细胞沉淀重悬于 1mL 室温1×红细胞裂解液，室温避光孵育5min裂解红细胞。
步骤 11 终止裂解并洗涤
(18)PBS补足至50mL，365×g、4℃离心5min，弃上清。
步骤 12 细胞重悬与计数
(19)细胞沉淀用1mLPBS重悬；取10μL细胞悬液 + 10μL 0.4%台盼蓝混匀，加入计数板计数活细胞，细胞悬液可直接用于后续流式染色。
三、实操优化技巧
1、消化缓冲液现配优先胶原酶活性依赖室温环境，缓冲配制后短期室温放置；若配制后数小时才使用，需冰浴保存延缓酶失活；可根据实验需求调整FBS浓度（5% 替代10% 或无血清消化），FBS 会轻微抑制胶原酶活性，本文体系10% FBS不影响解离效果。
2、全程减少细胞丢失消化后的6孔板、细胞筛必须PBS润洗并合并滤液；离心后吸取上清而非直接倾倒，避免沉淀细胞随废液流失。
3、样本新鲜度是核心变量新鲜组织解离后流式、单细胞测序结果远优于冻融样本；若实验需分批处理，统一使用新鲜或统一冻存样本，禁止新鲜/冻存混测，消除组间偏差。
4、低温保护策略Ficoll 离心完成后的所有洗涤、重悬步骤，均使用 4℃预冷 PBS，稳定细胞表面抗原，降低细胞凋亡、保证表面标志物完整。
5、下游拓展适配本方案制备的单细胞悬液除流式 DC 检测外，可用于细胞分选、磁珠富集、RNA 测序、功能体外刺激实验。
此外，笔者梳理多篇相关文献，汇总不同实验场景适用的肺组织解离方案，以供大家参考选用：
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文献：
[1] Diana Dudziak, Lukas Heger, William W Agace4,Joyce Bakker，etc,Guidelines for preparation and flow cytometry analysis of human nonlymphoid tissue DC，《European Journal of Immunology》2025
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