流式样本处理---皮肤组织处理
皮肤作为人体最大的屏障器官，富含树突状细胞、巨噬细胞、T 细胞、固有免疫细胞等多种免疫亚群，是皮肤炎症、自身免疫病、皮肤肿瘤免疫研究的核心取材组织。流式细胞术是解析皮肤组织免疫细胞分群、表型特征及活化状态的关键技术，而高质量、低表型损伤的单细胞悬液是流式上机检测的前提；皮肤组织致密、胶原纤维与脂肪组织丰富，常规裂解方案易出现消化不充分、细胞大量死亡、表面标志物降解等问题，因此需要一套标准化组织解离流程平衡细胞得率与抗原稳定性。
目前针对皮肤非淋巴组织树突状细胞及各类皮肤免疫细胞的流式检测尚无统一操作标准，不同实验室消化酶体系、孵育时长、样本前处理方式差异较大，直接导致细胞产量、活细胞比例、表面分子表达水平出现明显组间偏差。本文整理的操作规范源自权威文献《Guidelines for preparation and flow cytometry analysis of human nonlymphoid tissue DC》[1]，由一线实验从业者撰写、行业同行专家评审，且经全体作者共同核验确认，是适用于基础免疫、临床肿瘤免疫研究的通用标准化操作指南，特此分享供各位科研人员参考借鉴。
一、实验试剂与耗材
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实验试剂
1) 消毒培养基：RPMI添加50 μg/mL庆大霉素，4℃最多保存3周；
2) R10完全培养基：RPMI + 10%热灭活胎牛血清+ 2 mM L -谷氨酰胺+ 50 μg/mL庆大霉素，4℃最多保存3周；
3) IV型胶原酶储存液：5mg/mL，以含钙镁Hank’s平衡盐溶解，分装，- 20℃冻存；
4) DNase I储存液：10 mg/mL，5 mM氯化钙水溶液配制，0.22 μm滤菌后分装- 20℃；
5) 酶消化工作液：2 mL R10培养基 + 500 μL IV型胶原酶储存液，胶原酶终浓度1 mg/mL。
2. 实验器材
手术刀、镊子、100 mm大培养皿、60mm小培养皿、6孔板、5/10/25 mL移液管、100μm 细胞筛、2 mL注射器（活塞用于研磨组织）、37℃细胞培养箱、Heraeus Multifuge 3 S-R 离心机、血细胞计数板。
二、实验操作步骤
步骤1皮肤样本消毒与修剪
(1) 样本来源：整形手术废弃腹部/乳房全厚皮肤；
(2) 消毒处理：皮肤置于含30 mL RPMI+30 μL庆大霉素的50 mL管，完全浸没孵育至少30 min；
(3) 脂肪剔除：皮肤真皮面朝上置于大无菌培养皿，无菌剪刀/手术刀完全剔除皮下脂肪；
(4) 切块：翻面表皮朝上，裁剪为5×5 mm小块用于消化。
步骤 2 酶解消化
(5) 配制酶工作液加入小培养皿，放入5×5 mm皮肤组织块；
(6) 37℃孵育消化：最短6 h，最长不超过16 h（过夜消化）。
步骤 3 制备单细胞悬液
(7) 消化结束后，多次轻柔吹打组织；
(8) 混合液过100 μm细胞筛，使用注射器活塞挤压残留组织充分释放细胞；
(9) R10培养基冲洗培养皿与细胞筛，所有液体收集至离心管；
(10) 485 × g、4℃离心 5 min，弃上清；
(11) 沉淀重悬于1–2 mL R10 培养基，血细胞计数板计数，同时统计死细胞比例（正常≤20%–30%）；
*细胞产量参考：一块 5×5 cm皮肤消化后可获得200–500万细胞。
三、实验要点
1.培养基选择：含FCS培养基会降低胶原酶活性，但可更好保护细胞膜表面抗原，可设置有无FCS对照组优化方案；
2. 样本对比：全程保持样本低温、操作快速，减少细胞死亡与表型漂移。
3. 皮下脂肪必须彻底修剪，脂肪残留会阻碍酶与组织接触，消化不完全；组织需切至5×5 mm甚至更小碎片；
4. 消化时间延长会影响某些marker的表的，如下调CD1a、上调CD40、CD80、CD86共刺激分子，改变细胞活化表型。
此外，笔者梳理多篇相关文献，汇总不同实验场景适用的皮肤组织解离方案，以供大家参考选用：
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文献：
[1] Diana Dudziak, Lukas Heger, William W Agace4,Joyce Bakker，etc,Guidelines for preparation and flow cytometry analysis of human nonlymphoid tissue DC，《European Journal of Immunology》2025
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