直接和间接的免疫荧光

直接和间接免疫荧光:

免疫荧光 (IF) 或细胞成像技术使用抗体将荧光染料（也称为荧光素或荧光物）标记到特异性目标抗原上，所用荧光染料有诸如异硫氰酸荧光素 (FITC) 等。而通过化学方法偶联荧光素的抗体被广泛使用于IF实验中。
荧光素的使用使得用户通过荧光显微镜（例如表面荧光显微镜和共聚焦显微镜）观察样品中的靶标分布情况。根据荧光素与一抗还是二抗偶联，我们将 IF 方法分为两类：

直接 IF-使用单个抗体，该抗体直接指向目的靶标，一抗与荧光素直接偶联。

间接 IF-使用两个抗体，一抗未偶联，荧光素偶联的二抗指向一抗，并用于检测。

下图描述了直接和间接方法:

如下表所示，两种方法各有利弊

	直接	间接
时间	直接 IF 的实验方案通常较短，因为它只需要一个标记步骤。	使用偶联二抗检测一抗会增加额外的操作步骤。
成本	偶联一抗通常比未偶联一抗更贵。	与一抗相比，二抗相对更便宜。使用相同的偶联二抗检测不同的一抗能进一步节约成本。
复杂度	直接方法的实验方案步骤较少，更简单。	间接方法中必须选择适当的二抗，增加了复杂度。这种情况在需要使用多个二抗的多色实验中尤为突出，每个二抗需要靶向不同的物种并偶联至不同染料。
灵活性	市场上可获得的偶联一抗限制了灵活性。	不同偶联二抗的可用性大大增加了灵活性。
灵敏度	直接方法中获得的信号与间接方法相比可能较弱，因为直接方法中没有使用二抗进行信号放大。	多个二抗结合一抗可使信号放大。
物种交叉反应性	直接方法中，物种交叉反应被降至最低，因为荧光素已经与一抗偶联。	二抗可能与不是靶标的生物体发生交叉反应。使用预吸附二抗能防止交叉反应。
背景	使用偶联一抗可减少非特异性结合。	间接方法中，含有内源性免疫球蛋白的样品可能显示高背景。

直接和间接方法不仅仅限于免疫荧光。它们也与其它依赖于荧光素偶联抗体的技术相关，例如流式细胞术、ELISA 和免疫组化。检测低丰度蛋白有时很困难，间接检测法也不例外。生物素修饰的抗体可以在原抗原-抗体复合物之外额外增加一层蛋白结合，从而达到信号放大的作用。

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