• 概述

    蛋白质印迹(Western Blot,WB)又称免疫印迹,是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性,现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。

  • WB实验流程图
    WB样品制备指南

    样品制备是WB的关键步骤。适当的样品处理方式可确保您能够检测到目标蛋白。以下是WB样品制备的一般操作方法。

    【细胞】

    1. 分离细胞:使用预冷的PBS洗涤并分离细胞。对于贴壁细胞,使用细胞刮/消化液令细胞脱落。 对于悬浮细胞,离心悬浮液以分离细胞沉淀。
    2. 细胞裂解:使用添加了蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解细胞。
    3. 超声破碎:上述细胞样品放置于冰上,低强度、短促超声处理以破坏细胞膜结构,同时可以避免蛋白大量变性。
    4. 离心:超声处理的裂解物于4℃低温离心,并收集上清液。
    5. 蛋白质定量:使用Bradford法检测蛋白质浓度。
    6. 样品稀释和热处理:蛋白质定量后,用凝胶上样缓冲液/样品缓冲液稀释样品,并在95-100°C加热5-10分钟。

    【组织样本】

    1. 均质化:将较小的实体组织浸入预冷的裂解缓冲液中,并使用电动均质器均质化。对于较大的组织样品,使用搅拌器将组织在PBS中匀浆,然后用裂解缓冲液处理以破坏细胞膜。
    2. 超声破碎:上述细胞样品放置于冰上,低强度、短促超声处理以破坏细胞膜结构,同时可以避免蛋白大量变性。
    3. 离心:超声处理的裂解物于4℃低温离心,并收集上清液。
    4. 蛋白质定量:使用Bradford法估算蛋白质浓度。
    5. 样品稀释和热处理:蛋白质估计后,用凝胶上样缓冲液/样品缓冲液稀释样品,并在95-100°C加热5-10分钟。
    WB常见问题及解决方案
    问题 可能原因 验证或解决办法
    条带背景较高 未进行非特异性封闭或封闭不充分 延长封闭时间,更换封闭剂
    一抗浓度过高 增大一抗稀释倍数
    抗体孵育温度过高 4℃孵育
    二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应 在孵育和洗涤液中加入温和去污剂如Tween-20。脱脂奶粉含有酪蛋白,该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白,会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。使用BSA代替奶粉作为封闭剂
    一抗或二抗与封闭剂有交叉反应 在孵育和洗涤液中加入Tween-20以减少交叉反应
    膜不结合 NC膜比PVDF膜背景低
    未结合蛋白质洗涤不充分 增加洗涤次数
    缓冲液污染 尽量使用新配置的缓冲液
    膜干燥 保证充分的反应液,避免出现干膜
    阳性条带弱或没有信号 一抗、二抗等不匹配 订购试剂之前确认样品的种属来源,二抗的反应种属与一抗的种属来源相匹配
    抗体的浓度低,孵育时间短 增加抗体浓度,延长孵育时间
    封闭剂与一抗或二抗有交叉反应 封闭时使用温和的去污剂,如Tween-20或更换封闭剂
    抗原量不足或者蛋白样品降解 设置阳性对照,如果阳性对照有结果,但标本中没有则可能是标本中不含靶蛋白或是靶蛋白的含量太低,后者可增加标本的上样量至30ug每孔,尽量使用新鲜的样本组织,样本制备时需要使用蛋白酶抑制剂或分级提取目的蛋白需要查阅文献确认样品中目的蛋白的表达量
    转膜不充分或洗膜过度 使用丽春红检测转膜结果,PVDF膜需要浸润,勿过度洗膜
    过度封闭 使用含0.5%的脱脂奶粉,减少封闭时间
    一抗失效 使用有效期内抗体,分装保存,避免反复冻融,工作液现配现用
    二抗受叠氮钠抑制 所有的溶液和容器中避免含叠氮化钠(HRP的抑制剂),叠氮钠可以用于碱性磷酸酶结合的抗体中,而无副作用。
    酶和底物失效 直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活,选择在有效期内、有活性的酶联物,使用新鲜的底物
    曝光时间短 延长曝光时间
    一抗不识别检测物种的蛋白 参照说明书,比对免疫原序列和蛋白序列以确保抗体和目的蛋白会发生反应,设置阳性对照
    组织中目的蛋白含量低 查阅NCBI或相关文献,确认样品中目的蛋白的含量高低,浓缩使信号最大化(例如检测核蛋白要用核裂解物)。
    胶和膜放反了,如果在转印的过程中,胶和膜的位置颠倒了,那么蛋白就从胶上转移到缓冲液中,而不会到达膜上。 对于标准的转印,凝胶应靠近三明治的负极,而膜对应正极
    转膜效率受多种因素影响,包括蛋白的大小、凝胶中丙烯酰胺的百分比、电场强度、转印时间和缓冲液的PH值。一般来说,蛋白越大,转移的越慢。转移大蛋白最好的方法是用高的电场强度。而小蛋白长时间处于高电场强度下可能会传出转印膜。 用0.2μm孔径的PVDF膜进行转印。如果蛋白的等电点接近缓冲液的pH值,那么这个蛋白携带的电荷很少,在电场中也几乎不移动。如果你的目的蛋白是强碱性的,那么你可以用碳酸盐(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性缓冲液。
    检测系统缺乏足够的灵敏度 确保蛋白的上样量在检测系统的灵敏度范围内:
    辣根过氧化物酶 500pg/band
    碱性磷酸酶 100pg/band
    增强的碱性磷酸酶 5pg/band
    化学发光 10pg/band
    出现多条非特异性条带或条带位置发生错误 细胞传代次数过多 使用原始或传代少的细胞株,或平行实验
    体内表达的蛋白样本具有多种修饰:乙酰化、磷酸化、甲基化、烷基化和糖基化 查文献,使用去修饰的试剂使蛋白恢复其正确的大小
    蛋白样本降解 使用新鲜制备的标本,并使用蛋白酶抑制剂
    新蛋白或同族蛋白分享同种表位的不同剪接方式 查阅文献,或blast 搜索,使用说明书报导的细胞株或组织
    一抗浓度过高 降低抗体浓度
    二抗浓度过高,产生非特性结合 降低抗体浓度,选择特异性更强,只针对重链的二抗
    抗体未纯化 使用单克隆或亲和纯化的抗体,减少非特异条带
    蛋白存在二聚体或多聚体 SDS-PAGE电泳上样前,煮沸10min,以增强蛋白质解聚变性
    背景有白色或黑色斑点 转膜时有气泡或抗体分布不均匀 尽量去除气泡,抗体孵育时保持摇动
    膜激活不完全不均一 要完全浸泡
    抗体与封闭剂结合 过滤封闭剂
    条带黑色部分内部出现白色区域 一抗或二抗加入过多 稀释抗体浓度
    显色底物过度消耗或是过曝 减少样品上样量、改用低灵敏度的底物、减少曝光时间
    目的条带的位置过高或过低 SDS-PAGE的胶浓度选择不合适 调整胶浓度,分子量大的蛋白选择低浓度胶
    条带向下弯曲,呈“微笑”形状 迁移过快,电泳温度过高 降低电泳速度,低温电泳
    转膜不充分 膜没有完全均匀湿透 使用100%的甲醇浸润膜
    靶蛋白分子量小于100Kda 使用小孔径膜,缩短转膜时间
    靶蛋白的等电点接近转移缓冲液的PH值 更换缓冲液,换成CAPS缓冲液或是乙酸缓冲液
    甲醇浓度过高 过高的甲醇浓度会导致蛋白质和SDS分离,从而沉淀在凝胶中,同时也会使凝胶收缩或变硬,从而抑制高分量蛋白的转移,降低甲醇的浓度或使用乙醇
    转移时间不够 延长转膜时间
  • 蛋白提取

    ——裂解液、蛋白酶和磷酸酶抑制剂

    裂解液的选择取决于目的蛋白的含量、亚细胞定位以及选择识别蛋白天然形式还是变性形式的抗体。如果使用的抗体只能识别蛋白质的天然形式,那么不能选择含有SDS的裂解液,含有SDS的裂解液对蛋白有变性作用,而应该选择含有温和型非离子型去污剂的裂解液,如NP-40和Triton X-100。研究蛋白质-蛋白质相互作用时,一般用含有非离子型去污剂的裂解液。

  • 蛋白定位 裂解液推荐
    细胞质(细胞骨架) Tris-Triton
    细胞质(可溶性) Tris-HCL
    细胞膜 NP-40/RIPA
    线粒体 RIPA
    细胞核 RIPA
    全细胞 NP-40/RIPA

    蛋白酶和磷酸酶抑制剂进行细胞裂解的时候,蛋白也会进行降解。为了防止蛋白水解和脱磷酸化,必须一直将样品放在冰上。用之前将蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂添加到裂解液中以减缓蛋白水解和脱磷酸化的过程。

    抑制剂 抑制剂靶标
    抑肽酶(Aprotinin) 胰蛋白酶,糜蛋白酶,纤溶酶
    EDTA 需要Mg+和Mn2+的金属蛋白酶
    EGTA 需要Ca2+的金属蛋白酶
    亮肽素(Leupeptin) 溶酶体Lysosomal
    氟化钠 丝氨酸/苏氨酸磷酸酶
    原钒酸钠(Na Orthovanadate) 酪氨酸磷酸酶
    胃蛋白酶抑制剂A(Pepstatin A ) 天冬氨酸蛋白酶
    PMSF 丝氨酸,半胱氨酸蛋白酶

    蛋白定量

    ——考马斯亮蓝(Bradford)法蛋白定量试剂盒

    考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合,颜色深浅随蛋白质含量不同而变化,反应结束后颜色可在1h内保持稳定。

    产品名称 规格 产品编号
    考马斯亮蓝(Bradford)法蛋白定量试剂盒 50 tests/ 100 Tests 4AW010
    Coomassie brilliant blue G250 5g 4APA021

    Bradford法相对于BCA蛋白定量法

    优点:灵敏度高,干扰物质少;测定操作简便,只需5-10min;其结合物在室温下1h内保持稳定。

    缺点:高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去垢剂对测定有干扰。

    电泳

    ——上样缓冲液&电泳液、SDS-PAGE凝胶配制试剂、预制胶、蛋白Marker和蛋白胶染色

    上样缓冲液 & 电泳液。

    某些抗体特异性识别目标蛋白的部位可能存在于蛋白的三维构型内部,为了使抗体接近抗原表位,必须将蛋白的三维构型打开,即蛋白变性。要使蛋白质变性,使用含阴离子变性去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)的上样缓冲液,95-100℃煮沸5分钟,如果是跨膜蛋白,建议70℃加热5-10min。 某些抗体识别的表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构,这种情况下需要进行非变性的WB,抗体说明书一般会标注,这种非变性电泳一般不加SDS,样本也不需要煮沸,某些抗体仅识别蛋白的非还原态,loading buffer和电泳液中不加DTT。除了特殊说明,一般情况下均使用变性和还原电泳。
    产品名称 规格 产品编号
    非变性PAGE蛋白上样缓冲液(5X) 2ml 4APA012
    非变性非还原性蛋白上样缓冲液(5X) 2ml 4APA013
    SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(1X) 10ml 4APA009
    SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(2X) 5ml 4APA010
    SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X) 2ml/15ml 4APA008
    SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X) 2ml 4APA011
    SDS-PAGE电泳液 1L/10X1L 4APA007
    产品名称 规格 产品编号
    HEPES电泳缓冲液(SDS-PAGE,粉末) 500ml 4APA014-05
    HEPES电泳缓冲液(SDS-PAGE,粉末) 5L 4APA014-50
    HEPES电泳缓冲液(Native-PAGE,粉末) 500ml 4APA015-05
    HEPES电泳缓冲液(Native-PAGE,粉末) 5L 4APA015-50
    Tris-Tricine阳极缓冲液(5X) 500ml 4APA016-05
    Tris-Tricine阴极缓冲液(5X) 500ml 4APA017-05

    SDS-PAGE凝胶配制试剂

    电泳之前需要配置凝胶,凝胶适用于分离多大分子量的蛋白取决于凝胶的孔隙大小。四正柏生物可提供SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒以及各种配胶试剂,基本囊括了SDS-PAGE凝胶配制的需求。
    产品名称 规格 产品编号
    SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒 1盒 4APA006K
    SDS-PAGE凝胶配制试剂盒 1盒 4APA005K
    TEMED 四甲基乙二胺 10ml 4APA027
    SDS 十二烷基硫酸钠 80g 4APA025
    0.5M Tris-HCl,pH8.0 100ml 4APA026
    1.5M Tris-HCl,pH8.8 100ml APA030
    10%SDS 100ml MBB0004
    1M Tris-HCl, pH6.8 100ml 4APA028
    1M Tris-HCl,pH7.4 100ml 4APA031
    1M Tris-HCl,pH7.6 100ml 4APA032
    1M Tris-HCl,pH8.0 100ml 4APA033
    1M Tris-HCl,pH8.8 100ml 4APA029
    30% Acr-Bis (29:1) 100ml 4APA018
    3M NaAc pH5.2 100ml MBB0003
    40% Acr-Bis (39:1) 100ml 4APA019
    Ammonium persulfate (APS) 10g 4APA020

    一般来说,对于分子量小的蛋白,应配制含丙烯酰胺浓度较高的凝胶。对于分子量较大的蛋白,应配制含丙烯酰胺浓度较低的凝胶。以下表格整理了不同的蛋白线性分离范围所推荐的胶的丙烯酰胺含量。

    丙烯酰胺浓度(%) 蛋白质线性分离范围(kD)
    5.0 57-211
    7.5 36-94
    10 16-68
    15 12-43

    以下是10%分离胶和浓缩胶的配方。

    10%分离胶配方
    试剂 试剂
    H2O 5.9 ml
    30% Acrylamide-Bis 5 ml
    1.5M Tris pH 8.8 3.8 ml
    10% SDS 150 µl
    10% APS 150 µl
    TEMED 6 µl
    浓缩胶配方
    试剂 试剂
    H2O 2.7 ml
    Acrylamide-Bis 670 µl
    Tris pH 6.8 500 µl
    10% SDS 40 µl
    10% APS 40 µl
    TEMED 3 µl

    预制胶

    Hepes-Tris体系 Tris-Glycine体系 Triscine体系

    产品优势:

    可以兼容大部分的mini 电泳槽
    Bio-Rad Mini-PROTEAN(II/3/Tetra System)
    Hoefer Mighty Small(SE250/SE260/SE280)
    Life Technology Novex Mini-Cell
    其它胶板宽度在10cm的电泳槽
    保质期长
    HEPES体系预制胶2~8℃冷藏,不可冷冻,保质期18个月
    Tris-Glycine体系预制胶2~8℃冷藏,不可冷冻,保质期12个月
    Tricine体系预制胶2~8℃冷藏,不可冷冻,保质期1个月
    预制胶中均不含有SDS
    可用于变性与非变性蛋白凝胶电泳。 随货配有专门的的缓冲溶液
    蛋白非特异性吸附少
    产品采用玻璃板封装,可有效减少蛋白非特异性吸附,使蛋白条带更尖锐,清晰。
    稳定性和重复性俱佳
    采用自动化的灌胶生产技术,确保了产品质量的高稳定性和重复性。
    多类型选择
    凝胶厚度1.5 mm,具有10和15上样孔两种规格,每种规格有6%、7.5%、8%、10%、12%、15%、4%-12%、4%-15%、4-20%、8-16%、8-20%十一种浓度的现货产品可供选择。
    HEPES-Tris和Tris-Glycine两种体系蛋白电泳预制胶比较
    参数 Hepes-Tris体系预制胶 Tris-Glycine体系预制胶
    分辨率 中等
    电压及电泳时间 150V,40-50min 180V,60min
    电泳缓冲液 提供变性或非变性蛋白专用电泳缓冲液 普通Tris-Glycine缓冲液
    Hepes-Tris体系相关产品
    产品名称 规格 产品编号
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 6%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-060TS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 6%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-060TN
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 7.5%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-075TS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 7.5%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-075TN
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 8%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-080TS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 8%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-080TN
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 10%,10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-100TS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 10%,10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-100TN
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 12%,10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-120TS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 12%,10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-120TN
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 15% ,10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-150TS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 15% ,10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-150TN
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 4-12%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-412TS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 4-12%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-412TN
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 4-15%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-415TS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 4-15%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-415TN
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 4-20%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-420TS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 4-20%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-420TN
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 8-16%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-816TS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 8-16%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-816TN
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 8-20%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-820TS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 8-20%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-820TN
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 6%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-060FS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 6%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-060FN
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 7.5%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-075FS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 7.5%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-075FN
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 8%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-080FS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 8%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-080FN
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 10%,15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-100FS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 10%,15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-100FN
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 12%,15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-120FS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 12%,15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-120FN
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 15% ,15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-150FS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 15% ,15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-150FN
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 4-12%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-412FS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 4-12%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-412FN
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 4-15%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-415FS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 4-15%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-415FN
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 4-20%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-420FS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 4-20%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-420FN
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 8-16%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-816FS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 8-16%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-816FN
    变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 8-20%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-820FS
    非变性蛋白预制胶 Hepes-Tris 8-20%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒(含runningbuffer) 4APA034H-820FN
    Tris-Glycine体系相关产品
    产品名称 规格 产品编号
    预制胶 Tris-Glycine 6%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-060T
    预制胶 Tris-Glycine 7.5%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-075T
    预制胶 Tris-Glycine 8%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-080T
    预制胶 Tris-Glycine 10%,10 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-100T
    预制胶 Tris-Glycine 12%,10 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-120T
    预制胶 Tris-Glycine 15% ,10 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-150T
    预制胶 Tris-Glycine 4-12%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-412T
    预制胶 Tris-Glycine 4-15%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-415T
    预制胶 Tris-Glycine 4-20%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-420T
    预制胶 Tris-Glycine 8-16%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-816T
    预制胶 Tris-Glycine 8-20%, 10 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-820T
    预制胶 Tris-Glycine 6%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-060F
    预制胶 Tris-Glycine 7.5%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-075F
    预制胶 Tris-Glycine 8%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-080F
    预制胶 Tris-Glycine 10%,15 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-100F
    预制胶 Tris-Glycine 12%,15 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-120F
    预制胶 Tris-Glycine 15% ,15 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-150F
    预制胶 Tris-Glycine 4-12%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-412F
    预制胶 Tris-Glycine 4-15%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-415F
    预制胶 Tris-Glycine 4-20%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-420F
    预制胶 Tris-Glycine 8-16%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-816F
    预制胶 Tris-Glycine 8-20%, 15 wells, 1.5 mm 10片/盒 4APA034G-820F
    Tris-GlycineTriscine体系相关产品
    产品名称 规格 产品编号
    预制胶 Tricine 16.5% 10wells 1.5mm 10片/盒(含阴阳极缓冲液) 4APA034T-165T
    预制胶 Tricine 16.5% 15wells 1.5mm 10片/盒(含阴阳极缓冲液) 4APA034T-165F

    蛋白Marker

    蛋白Marker在WB实验中扮演重要作用,可以给我们判断目标蛋白的位置提供参考。四正柏提供多种分子量范围的彩色预染和未预染蛋白Marker,便于在WB实验过程中选择不同的内参抗体,对不同大小的目的蛋白进行分析。
    产品名称 规格 产品编号
    非预染低分子量蛋白质Marker(14.4-97 kDa) 0.5 ml MPM9201
    彩色预染蛋白Marker(10.5-175 kDa) 250 ul×1/×5/×10 MPM9202
    彩色预染蛋白Marker(11-180 kDa) 250 ul×1/×5/×10 MPM9203
    彩色预染宽范围蛋白Marker(11-245 kDa) 250 ul×1/×5/×10 MPM9204
    彩色预染宽范围蛋白Marker(5-245 kDa) 250 ul×1/×5/×10 MPM9205
    预染宽范围蛋白Marker(10-180 kDa) 500 ul×1/×5/×10 MPM9206
    彩色预染超宽范围蛋白Marker(6.5-270KDa) 250 ul×1
    500 ul×1/×2/×5
    MPM9207

    蛋白胶染色

    凝胶电泳分离的蛋白质凝胶可以通过两种方式显色:考马斯亮蓝(Coomassie)染色或铜(copper)染色。染色方式的选择很大程度上取决于蛋白质的下游应用。
    考马斯亮蓝染色是用来确定蛋白质是否均匀地迁移。如果目的不是转膜而仅仅是观察SDS-PAGE胶上蛋白分离结果,那么就选用考马斯亮蓝染色。因为考马斯亮蓝对蛋白质的染色是不可逆的,所以考马斯亮蓝染色只能用于凝胶染色。
    产品名称 规格 产品编号
    Coomassie brilliant blue R250 5g 4APA022

    转膜

    ——转膜液、蛋白膜染色

    转膜液

    蛋白样品经过SDS-PAGE电泳分离后,需要从PAGE胶转移至膜上固定。转膜效果的影响因素主要有膜的选择、转膜方法和实验操作三个方面。
    湿转 半干转
    实验原理 海绵/纸/胶/膜/纸/海绵,全部紧密排列,胶和膜之间不能留有气泡,三明治安放的方向需确认正确,负极方为带负电蛋白的胶,向正极方向迁移。 三明治排列方式:纸/胶/膜/纸,用电转缓冲液浸湿后,直接置于电转仪的正负极之间,胶位于负极膜位于正极。
    应用范围 大小蛋白,比较常用 可以同时高效转移大小不同的蛋白
    优点 大分子蛋白转膜效果更优 需要的缓冲液比较少不适于长时间转移,小分子蛋白的转膜效果更好
    缺点 需要的缓冲液比较多,转移速度比较慢 某些情况下容易产生高背景
    产品名称 规格 产品编号
    Western Blot转膜液 1L/10L 4AW001
    Western Blot半干法转膜液 1L/10L 4AW002

    蛋白膜染色

    蛋白转膜的效率和成功与否可以通过将PVDF或硝酸纤维膜(NC膜)用丽春红(Ponceau Red)染色检测。丽春红对蛋白质的染色是可逆的,可用TBST缓冲液洗去,因此能够进行随后的抗体检测。
    产品名称 规格 产品编号
    丽春红染色液 120 mL 4AW003

    封闭

    ——封闭液、洗涤缓冲液

    封闭液

    封闭的目的在于将除目的蛋白外其他无结合蛋白的位置封闭起来,防止抗体孵育过程中抗体的非特异性结合而产生较深的背景信号。常用的封闭剂包括脱脂奶粉、BSA(牛血清蛋白)、其他动物血清等,不同的抗原抗体反应,封闭条件是有差异的。(当使用磷酸化蛋白的抗体进行检测时,建议使用BSA封闭。)
    产品名称 规格 产品编号
    Western Blot封闭液 100 mL 4AW005

    洗涤缓冲液

    为了去除任何未结合的试剂,并降低背景,洗涤步骤是Western blot中很有必要的一个环节。洗涤不充分会导致高背景信号,洗涤次数过多,又会造成蛋白从膜上被洗掉。洗涤缓冲液中使用的去污剂的量可能会根据实验而有所不同。Tween-20去污剂的浓度可以从0.05%到0.5%不等。建议使用新鲜的高纯度去污剂。
    产品名称 规格 产品编号
    Western Blot洗涤液 250mL 4AW006
    TBS缓冲液(20X) 500mL 4AW013

    抗体孵育

    —— 一抗、二抗、内参抗体、标签抗体、抗体稀释液

    一抗

    一抗种类多达20000多种,产品覆盖肿瘤、代谢、神经退行性疾病、表观遗传学、免疫学、传染病、心血管疾病等领域。产品包括细胞凋亡研究热门抗体、MAPK-JNK信号通路抗体、PI3K-AKT信号通路抗体、表观遗传-组蛋白修饰抗体以及神经退行性疾病研究抗体等。
    细胞凋亡 神经退行性疾病 表观遗传 MAPK-JNK信号通路 PI3K-AKT信号通路
    Bax Amyloid β Histone 1/2/3/4 Bim AKT 1/2/3
    Bcl-2 Klotho TET1 JNK1/2/3 BAD
    Caspase3 Tau TET2 TAK1 FOXO1/3/4
    Caspase8 α-Synuclein DNMT1 ASK1 PI3K
    P53 Huntingtin DNMT3
    查看更多一抗产品

    二抗

    二抗包括抗小鼠、大鼠、仓鼠、鸡、兔、人、羊等二抗,种类包括抗IgG(H+L) 、IgG1、 IgG3、 IgG F(ab’)2 、Light Chain等。
    查看相关二抗产品

    内参抗体

    对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins),它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。 内参抗体涵盖全细胞/细胞质蛋白(β-actin、α-actin、GAPDH、β-tubulin、α-tubulin、Vinculin)、线粒体(VDCA1/porin、Cytochrome C oxidase)、核蛋白(Lamin B1、TATA binding protein TBP、PCNA、Histone H1、Histone H3)、植物组织(LHCP、APX3)等多种种类。

    标签抗体

    标签蛋白是一类运用基因重组技术插入动物目标基因片段中的标记基因的表达产物,标记基因会与目标基因同时表达,故可籍以分析检目的蛋白的表达含量。四正柏的标签抗体涉及HA、HSV、His、V5、GST、Flag、C-myc等,规格有30ul和100ul两种。
    产品名称 规格 产品编号
    Mouse anti HA-tag Monoclonal Antibody 30uL/100uL 4ab000002
    Mouse anti HSV-tag Monoclonal Antibody 30uL/100uL 4ab000004
    Rabbit anti His-tag Polyclonal Antibody 30uL/100uL 4ab000005
    Rabbit anti V5-tag Polyclonal Antibody 30uL/100uL 4ab000006
    Rabbit anti GST-tag Polyclonal Antibody 30uL/100uL 4ab000008
    Rabbit anti FLAG tag antibody (DYKDDDDK) 30uL/100uL 4ab030002
    Rabbit anti C-Myc Polyclonal Antibody 30uL/100uL 4ab086893

    抗体稀释液

    抗体稀释度一般在说明书上可以查到相关信息。然而抗体的最佳稀释度可以根据实验的具体情况而变化。蛋白质表达量越大以及实验的灵敏度越高则需要的抗体越少。使用较少的抗体可以降低背景信号,增加抗原抗体反应的特异性。
    产品名称 规格 产品编号
    Western Blot一抗稀释液 100ml/250ml 4AW004
    Western Blot二抗稀释液 100ml 4AW007

    显色

    ——— HyperSignal® 高敏ECL化学发光底物、UltraSignal®超敏ECL化学发光底物

    UltraSignal®超敏ECL化学发光底物

    UltraSignal®超敏ECL化学发光底物是作为HRP最为敏感的色原底物,其检测水平可达飞克级。

    产品特点

    1. 超凡灵敏度
    与其他进口品牌超敏化学发光底物相比,具有更出众的检测灵敏度。飞克级灵敏度。
    2. 极低的非特异性
    背景非特异性背景极低,对比实验发现UltraSignal超敏化学发光底物是信噪比最高的,发表高分文章必选利器。
    3. 超高性价比
    使用UltraSignalTM 超敏化学发光底物可节省一抗试剂5-10倍,节省二抗试剂5-10倍,尤其适用于低丰度表达蛋白Western Blot检测。
    4. 可长期稳定保存
    常温条件下可稳定保存1年,4度可稳定保存两年。且兼容所有辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗。
    UltraSignal超敏ECL与进口同类产品对比。人铁传递蛋白稀释至5-0.5ng上样,并将蛋白样品从SDS-PAGE凝胶转移到PVDF膜上,一抗用兔抗铁传递蛋白1:4000稀释孵育,膜经清洗后,二抗用HRP标记的羊抗兔抗体1:40000稀释孵育。膜再次清洗后,用底物显色。所有底物都按说明书的最适条件进行显色,用富士4000成像仪进行仪成像,分别曝光30s、60s、90s和300s。
    产品名称 规格 产品编号
    UltraSignal 超敏ECL化学发光底物 10ml + 10ml 4AW011-20
    UltraSignal 超敏ECL化学发光底物 25ml + 25ml 4AW011-50
    UltraSignal 超敏ECL化学发光底物 50ml + 50ml 4AW011-100
    UltraSignal 超敏ECL化学发光底物 100ml + 100ml 4AW011-200
    UltraSignal 超敏ECL化学发光底物 250ml + 250ml 4AW011-500
    UltraSignal 超敏ECL化学发光底物 500ml + 500ml 4AW011-1000

    HyperSignal® 高敏ECL化学发光底物

    HyperSignal化学发光底物经专门设计用于检测膜上辣根过氧化物酶(HRP)的非放射性高灵敏度的增强底物,比普通ECL试剂灵敏度高数十倍。

    产品特点

    1. 灵敏度高,皮克级灵敏度
    2.非特异性背景低,信噪比高
    3.发光持续时间长
    4.稳定性高,可以常温保存1年
    5.经济型,性价比极高
    产品名称 规格 产品编号
    HyperSignal 高敏ECL化学发光底物 10ml + 10ml 4AW012-20
    HyperSignal 高敏ECL化学发光底物 25ml + 25ml 4AW012-50
    HyperSignal 高敏ECL化学发光底物 50ml + 50ml 4AW012-100
    HyperSignal 高敏ECL化学发光底物 100ml + 100ml 4AW012-200
    HyperSignal 高敏ECL化学发光底物 250ml + 250ml 4AW012-500
    HyperSignal 高敏ECL化学发光底物 500ml + 500ml 4AW012-1000