柏科普—流式对照设置全攻略：从空白到补偿，新手也能一次搞定
流式实验对照是整个实验成功的关键。可以帮助我们排除非特异性信号，获得高质量的实验数据和正确的实验结果。你知道有哪八个对照吗？
仪器对照
仪器对照是通过追踪激光器、检测器和流体性能，从而确认仪器是否正常工作。一般来说，这些对照涉及到仪器制造商提供或出售的校准颗粒或荧光微球。这些质量控制微球应在仪器运行的每一天使用。
空白对照（未染色对照）
第一次调试仪器时，额外准备一份细胞（处理或未处理），不加任何荧光染料。用来调节FSC和SSC通道的电压，同时通过分析细胞的自发荧光和背景荧光，确定阴性细胞群的位置。
补偿对照（单阳性对照）
校正溢漏的过程被称为补偿。补偿可确保检测器只计算该通道特定的荧光信号。补偿实验需要每种荧光染料的单染样品（即每个样品只染一种染料）。这些可以利用细胞或补偿微球来设置。在创建补偿对照时，注意以下四个基本原则：
1）补偿荧光染料必须与实验荧光染料完全匹配
a. 同一通道内的荧光染料仍具有不同的发射光谱，并且不可互换。例如，FITC不能作为GFP的补偿对照。
b. 由于复合染料的差异，实验中的复合染料标记抗体应当与补偿单染管所用的抗体完全相同（来自同一支抗体）。使用相同的复合荧光染料偶联不同的抗体、甚至仅是不同批次抗体，都可能会导致计算结果不准确。
2）补偿对照的亮度必须与实验样品相同或更高
例如，单染样品是APC标记的CD25抗原，由于CD25抗原是活化分子，未激活情况下抗原表达量较低，看不到明显的阴阳分群，可以用APC标记的高表达丰度的抗原如CD3抗原来替代。
3）如果用细胞来调节补偿，实验用细胞与补偿对照的细胞一样
例如，实验样本是人的PBMCs，做补偿对照时最好不用人的外周全血或小鼠的PBMCs。
4）收集足够多的事件
补偿依赖于荧光强度中位值的准确计算，如果事件太少，将无法准确计算。收集事件数应多于5,000 个。
图1：人PBMCs用FITC anti-human CD8抗体单染，观察FITC和PE通道的荧光溢漏情况。图中显示了（a）未补偿和（b）正确补偿的hCD8和hCD3的散点图
注：补偿微球与抗体重链结合，因此与生物样品不同，不需要特异性抗原识别。作为实用性补偿试剂，这些微球可提高补偿的一致性，特别适用于以下三种情况：
1. 阳性群体染色暗淡或稀少，补偿微球具有强烈的荧光信号，使得补偿对照的亮度与实验样品相同或更高；
2. 多种荧光染料或大批量实验；
3. 细胞数较少。不过在细胞数充足的情况下，尽量用实验细胞来调节补偿。
FMO对照
在分析流式细胞术的数据时，最关键的是正确设门。当细胞群体无法清晰界定或比较稀少时，需要荧光减一对照（Fluorescence Minus One，FMO）来辅助设门。FMO对照能够在多色实验中评估其他通道对某个通道荧光信号的溢漏，故能准确区分这个通道阴性和阳性细胞群体。
制备FMO对照是用所有荧光抗体染色细胞，去掉某一种荧光抗体。例如，如果利用FITC、PE、PE-Cy5和PE-Cy7开展四色实验，那么FMO对照可按照表1来设置：
图2 ：从左到右依次是（a）空白管（没加抗体），（b）FMO对照管（没加PE通道抗体）和（c）样本管（都加了抗体）。空白管用于确定背景荧光或自发荧光，而FMO对照更合适作为设门依据，区分阴性和阳性细胞群界限
特异性染色对照
抗体与细胞结合有三种基本形式：
1. Fab区域与抗原结合（理想情况）
2. Fc区域与Fc受体结合（通常不想要）
3. 非特异性结合（脱靶抗原、“粘”住细胞膜等)
在各种流式细胞术分析中，避免非特异性结合的最佳方法有：
☆ 做好抗体滴定
☆ 进行Fc受体封闭
☆ 加入活性染料排除死细胞
同型对照
同型对照（Isotype Control）可用于评估抗体的非特异性结合。同型对照是指与一抗的类别、亚型和荧光标记物一致，且用量相同，但对目标靶点无特异性结合的抗体。通过检测背景染色，同型对照可以指示实验步骤是否需要进一步优化。同型对照可用于确定：
1.细胞是否充分封闭。如果未完全封闭，同型对照将与Fc受体结合，导致荧光背景增加。
2.胞内指标染色期间是否充分洗涤。针对细胞内靶标的抗体即使不与抗原结合，也常常会被拦在细胞内与胞内物质结合，构成非特异性染色。
注：同型对照一直是流式细胞术中最常用的阴性对照之一。但是，完全匹配的同型对照必须与待测抗体有着相同的免疫球蛋白重链和轻链，而且荧光染料与抗体的偶联比例也相同。在同型对照不满足这些要求的情况下，必须小心背景染色的过度解读。对于多色流式组合，同型对照无法解释其他通道中的试剂所引起的背景荧光。因此并不足以准确地进行数据分析，常结合FMO对照用于设门。
生物学对照
生物学对照（Biological Control）对于所有染色都是重要的，但对于具有更高背景荧光的细胞内染色更重要。生物学对照包括已知的阴性样品和已知的阳性样品。如从文献中已知的表达或缺乏感兴趣抗原表达的细胞，或使用 siRNA 或 CRISPR 技术将抗原敲除的细胞产生阴性细胞，或已转染的细胞并且抗原被过度表达以确保阳性染色。对于一些实验，例如细胞因子释放检测，未刺激和完全刺激的样品对于确定阳性结果和细胞因子的动态变化是很重要的，如图2所示：
图2：C57BL/6小鼠脾脏细胞经PMA+Ion刺激（b）4h，同时加BFA，或者未刺激（a）。进行APC anti-mouse CD3e表面染色，细胞经固定破膜，胞内染色PE anti-mouse IFN-γ的流式图。未刺激组可作为刺激组的生物学对照
同抗对照
同抗对照（Isoclonic Control），是指先添加过量的未标记抗体再通过标记抗体进行染色。在该对照中，特异性抗体结合位点全部被未偶联的抗体占据，那么偶联抗体仅仅可以通过偶联物和样品结合。如果未检测到荧光信号，则表明偶联抗体不能通过其偶联物发生非特异性结合。主要用于评估荧光染料引起的非特异结合，并不用于类似同型对照中阳性百分比评估的计算作用。
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