柏科普-单细胞悬液的制备
在流式以及单细胞测序实验中，单细胞悬液的制备是最为关键的一环，特别是对于组织样本，单细胞悬液的制备将直接对实验结果造成巨大影响。为了帮助大家获得高质量的单细胞悬液，在本期小编就来分享一下在单细胞悬液的制备中需使用的一些酶及它们的作用。
首先我们了解下动物组织的组成，组织由胶原蛋白、非胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖与氨基聚糖5类物质组成，要得到高质量的单细胞悬液，必须解离这些基质，常用方法：机械破碎、酶解法或者二者配合。
在酶解实验中，影响实验的主要因素有：
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组织类型
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动物组织来源
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组织供体年龄
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基因修饰（敲除等）
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使用的解离介质
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使用的解离介质
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所用任何粗酶制剂中的杂质
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所用酶的浓度
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消化温度
下图有助于您选择合适的酶:
胶原酶(Collagenase)
胶原酶更准确地名称为梭菌肽酶A，它是一种对序列Pro-X-Gly-Pro中X-Gly键具有特异性的蛋白酶，其中X最常见的是中性氨基酸。这类序列常在胶原蛋白中发现，但在其他蛋白质中很少发现。它能攻击和降解结缔组织中常见的三螺旋天然胶原纤维。从而破坏胶原蛋白中存在的肽键，消化细胞外基质，使细胞释放到悬浮液中。
由于所有胶原多肽的不完全水解及其对细胞外基质中发现的高浓度非胶原蛋白和其他大分子的有限活性，纯化的梭菌肽酶A单独用于解离组织通常效率低下。最常用于组织分离的胶原酶是含有梭菌肽酶a以及许多其他蛋白酶、多糖酶和脂肪酶的粗制剂。粗胶原酶非常适合组织分解，因为它含有攻击天然胶原和网状纤维所需的酶，以及水解结缔组织和上皮组织细胞外基质中其他蛋白质、多糖和脂质的酶。
Worthington生产的胶原酶是含有各种酶（包括胶原酶，酪蛋白酶，梭菌蛋白酶，胰蛋白酶活性）的混合物，最适pH：6.3-7.5，激活剂：Ca²?、Zn²?，抑制剂：a2大球蛋白半胱氨酸、组氨酸DTT、2-巯基EDTA、EGTA Hg2+和其他重金属离子邻菲咯啉。常用剂量为最终浓度200U/ml（约为1mg/mL）或0.03%~0.3%。胶原酶常用的主要分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型. 其特征如下：
其他几种常与胶原酶配合使用的酶
实验操作
注意细节
1、如前所述，酶的选择与样本种属、供体来源、年龄、状态都有关联，可根据文献选择酶的类型。
2、预实验确定各种酶的使用浓度和酶解时间，如果实验中要求使用两种或两种以上的酶，那么优化主要酶的浓度和培养条件后，再评估任何次要酶。例如，如果两个最相似的参考文献引用了0.1%的胶原酶和0.01%的脱氧核糖核酸酶I以及0.075%的胶原酶和0.025%的透明质酸酶，则优化评估胶原酶浓度（建议预实验胶原酶浓度梯度：0.05%、0.075%、0.10%、0.125%、0.15%），再评估评估透明质酸酸酶或脱氧核糖核酸酶的浓度。
3、评价实验结果，需要考虑所得细胞的数量和活性。
应用举例
关于使用worhtington酶Tips
胶原酶
通常在平衡盐溶液（例如Hank's，Earle's等）中以0.05％至0.5％（w / v）的浓度使用。为获得最佳结果，胶原酶的工作浓度需要根据组织以及参考文献进行调整。
胶原酶需要钙离子的存在才能发挥出活性。可溶于TES缓冲液（0.36mM氯化钙，pH7.5的0.05M TES）中，配置成1mg/ml储存液，配置完后可分装，避免反复冻融，溶液在-20℃可稳定保存数月。也可以用PBS，hanks，Earle's或培养基进行配制。（PBS若没有ca²?离子，可以补加1mmol/L CaCl2和0.5 mmol/L MgCl2）
DNA酶I
由于我们的DNA酶是来自胰腺的，其对震荡引起的物理变性异常敏感，很容易发生剪切变性，需要轻轻混合，混合应通过温和上下倒置完成。将标准小瓶溶解在1.0ml试剂级水(reagent grade water)中。打开小瓶时必须小心，以免冻干物质丢失。此溶液将包含标签上所述的单位数/ ml。
弹性蛋白酶
弹性蛋白酶在pH ≤ 3.5时是不稳定的，当以干粉的形式储存时，酶在2-8℃下稳定储存6-12个月。产品代码为ES和ESL的产品在中性pH和浓度大于0.25%时溶解性较差。在稀释到反应混合物或溶液介质中之前，在KCL或碱性缓冲液中先配制好初级溶液（有利于补偿离子强度或pH变化）。弹性蛋白酶在pH4.0-10.4中是稳定的。
木瓜蛋白酶
使用：粉末状木瓜蛋白酶溶于水(10mg/ml)形成储存液。在使用之前，通常在含有~5 mM L-半胱氨酸的缓冲液中进行稀释。
活化：木瓜蛋白酶最适pH范围为6.0-7.0，使用前应在活化液中孵育，以确保充分活化。活化方法：将酶在含有1.1mM EDTA，0.067mM巯基乙醇和5.5mM半胱氨酸-HCl的溶液中孵育30分钟。建议在溶解后和使用前将酶通过0.22微米滤膜过滤。
RNA酶
在试剂级水中配制1 mg/ml的原液。
胰蛋白酶的溶解
在0.001N HCL（1mM HCL）溶液中溶解胰蛋白酶，制备成胰蛋白酶的储存溶液,分装并-20℃保存。在使用之前可以根据需求，将溶液立刻稀释到消化培养基或者是缓冲液中。
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