柏科普-细胞周期检测
我们都需要一个还不错的告别
告别过去，也告别那个不快乐的自己
大卫·利维森《无法完成的告别》
细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，细胞周期可以分为四个时相：G1(DNA 合成前期)；S 期 （DNA 合成期）；G2 期（DNA 合成后期）和M 期（有丝分裂期）。根据染色体的倍数进行分类分为三个时相：G1 期、S期和 G2/M 期三个时相。
采用流式方法来检测细胞周期，简单又方便，常用DNA染料：碘化丙啶（propidium iodide，PI）和7-氨基 - 放线菌素D（7-amino-actinomycin D ，7-AAD），PI和7AAD可以和双链DNA、RNA结合，因此实验中需要用RNase处理细胞。虽然有资料显示：7-AAD不和RNA结合，但是我们实验表明7—AAD染色时，添加RNase 效果更好。
实验操作
实验Tips
1、细胞悬液制备：组织细胞可以用含EDTA的0.25%的胰酶消化。
2、乙醇固定细胞：为了减少细胞粘连，将细胞悬液（细胞放在冰上）逐滴加到4倍体积预冷的95%乙醇里。固定2小时以上或者过夜。
3、染色时，避光。
4、PI具有很强的粘附性，容易形成细胞聚团，建议使用200目的筛网过滤后上机。
5、上机时，荧光通道设置为线性（lin）放大
6、为了减少CV，便于分析，需要低速流式上样。
7、便于统计分析，细胞数最少采集50000个。
8、数据分析，去除粘连细胞。
细胞粘连体是指实际样品中出现粘连的双细胞或多细胞团块(多数是双细胞)。因为流式分析的是单细胞，所以粘连体无法判断DNA的含量，从而影响数据的准确性。常用下面方法来圈门去除粘连体。首先我们了解下脉冲信号，当细胞通过激光束，检测器会接收到两类信号：光散射和荧光信号。每个脉冲信号都有三个参数：A、H、W。
电脉冲信号的面积(A)是指细胞穿过激光束过程中发射的总荧光。受PMT影响。
电脉冲信号的高度(H)是指细胞穿过激光束过程中发射的的最大荧光，受到PMT影响。
电脉冲信号的宽度（W）是指细胞通过激光束的时间，与细胞或者粒子大小相关，与PMT无关。
当粘连体通过检测器时，H 不变，而W 和 A都会变大，因此用A-H，A-W，W-H都可以将粘连体圈出。
数据分析实例：Jurkat细胞周期分析
FXP0211 PI细胞周期检测试剂盒流式图
图一 : 根据FSC、SSC排除碎片，E1圈定细胞；
图二 : 根据PI-H、PI-A排除粘连体，P2为单个细胞群；
图三 : G1、S、G2/M期分别如图。
FXP0311 7AAD细胞周期检测试剂盒流式图
图四 : 根据FSC、SSC排除碎片，E1圈定细胞；
图五 : 根据7-AAD-H、7-AAD-A排除粘连体，P2为单个细胞群；
图六 : G1、S、G2/M期分别如图。
产品 List
参考文献
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